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Le service de cryopréservation

- Cryopréservation des lignées par congélation de sperme

La prestation de congélation de sperme est proposée pour la plupart des fonds génétiques. Le cryoprotecteur utilisé est le CPA-MTG.
Sur chacun des sites, une personne référente est désignée à la congélation de lignée de souris génétiquement modifiée. Toutefois la préparation du milieu de congélation (CPA-MTG) est réalisée par le service pour l’ensemble des sites du RAM ainsi que la validation de ce dernier avant utilisation sur les différents sites.
Vous devez fournir minimum 2 mâles âgés entre 2 et 6 mois, de préférence des mâles reproducteurs. Le sperme des deux mâles est congelé dans 18 paillettes.

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Pour chaque lignée congelée sous forme de sperme, la quantité et la qualité du sperme sont évaluées de manière visuelle. Afin d´évaluer la viabilité mais aussi la fertilité du sperme congelé, un contrôle qualité est réalisé : une paillette de sperme est décongelée de façon aléatoire puis une FIV est réalisée. Le nombre d’embryons obtenus par rapport au nombre total d’ovocytes récoltés nous donne le taux de fécondation (efficacité du sperme).

Prendre note que, lors de la décongélation du sperme cryopréservé, la fécondation se fera à partir d’ovules de femelles "wildtype" (fond génétique correspondant à celle de votre lignée). Ainsi, si le sperme d’un mâle homozygote est cryopréservé, les souris produites suite à une décongélation seront automatiquement hétérozygotes. Des croisements seront alors nécessaires si vous désirez obtenir des souris homozygotes.
Le coût de cette procédure inclut les éléments suivants :
-  Une garantie de 18 paillettes de sperme congelés
-  La validation du contrôle qualité 1 par la technique de la FIV (passage au stade 2 cellules)

- Cryopréservation des lignées par congélation d’embryons (en perspective)

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Les embryons sont obtenus selon deux méthodes :
In vivo  : vous devez fournir un minimum de 10 à 30 mâles ainsi que 10 à 30 femelles (quantité variable en fonction du fond génétique de la lignée à cryopréserver). Les embryons sont récupérés par flushing des oviductes sous loupe binoculaire, suite à un accouplement contrôlé. Les embryons sont récoltés au stade 2 cellules.
par fécondation in vitro (FIV) : elle permet l´obtention d´embryons au stade 2 cellules, à partir de sperme congelé. Vous devez nous fournir au minimum 2 paillettes de sperme congelé. Pour cela, des ovocytes obtenus après super ovulation de jeunes souris femelles sont mis en contact avec des spermatozoïdes pendant 6 heures à l´étuve 5% CO2. Les ovocytes fécondés sont ensuite triés puis laissés à nouveau à l´étuve jusqu´au lendemain matin, jour du stade 2 cellules.
Quel que soit leurs origines (in vivo ou in vitro), les embryons obtenus sont sélectionnés sous microscope puis introduits dans des paillettes en présence de cryoprotecteur (1-2 propane diol), et congelés selon le protocole publié par protocole publié par Renard et Babinet en 1984 . Il s´agit d´une congélation lente par le congélateur progressif le Freezal où le refroidissement se fait par pallier et progressivement jusqu´à une température de -140°C. Les embryons sont alors plongés dans l´azote liquide et maintenus dans l’azote liquide. Par sécurité, l´archivage est également réalisé dans deux lieux distincts.
Pour chaque lignée congelée sous forme d´embryons, un test de viabilité est réalisé : une paillette d´une vingtaine d´embryons est sélectionnée aléatoirement et décongelée. Le nombre d´embryons viables obtenus par rapport au nombre total d´embryons décongelés correspond au taux de survie. Si le taux est jugé adéquat, le lot d’embryons sera validé.

- Revitalisation à partir de paillettes congelées / Redérivation par transferts d’embryons issus de FIV
Cette procédure permet l’échange, l’importation de lignée au sein du RAM. Elle permet également la décontamination d’une lignée.
Les embryons obtenus après décongélation de la paillette d’embryon ou après une FIV seront lavés 10 fois en pièce de cryo et 10 fois en pièce de réimplantation (statut SOPf). Les embryons au stade 2 cellules seront ensuite transférés dans l´infundibulum d´une femelle pseudo gestante (femelle B6CBAF1 accouplée avec un mâle vasectomisé Swiss).

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Contact : cryopreservationRAM@biocampus.cnrs.fr

FOR Demande d’envoi de paillettes de sperme embryon - 92.5 ko

FOR Demande de congélation de lignée - 384 ko

FOR Demande de revitalisation - 103.5 ko

FOR Demande de stockage de paillettes congelées - 391.5 ko

FOR Description de la lignée - 98.5 ko


 
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