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Service de transgenèse ciblée et cellules embryonnaires souches (ES)

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● Présentation du service

Le service de Transgenèse ciblée et Cellules ES a été créée en février 2008 au sein de l’Institut de Génétique Moléculaire de Montpellier (IGMM). Elle a pour but la production de lignées de souris knock-out, knock-in ainsi que la dérivation des cellules ES à partir des blastocystes de souris mutantes et transgéniques.

Ce service est ouvert à tous les scientifiques de Montpellier. La plate-forme a comme missions : le conseil, la production et la formation.

Les locaux sont constitués de deux laboratoires : l’un dédié uniquement à la culture des cellules ES et l’autre doté d’une station de micro-injection motorisée Leica.

● Localisation

Le service est située sur le site de l’IGM au sein de la nouvelle structure animalière et s’appuie pour son fonctionnement sur l’animalerie Transgénique A1


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Catalogue des prestations








● Organisation

Responsable scientifique et technique : Christina BEGON-PESCIA

● Contacts

Christina Pescia
Tél : 04.34.35.97.14

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● Fonctionnement

Le service interagit avec les équipes désireuses de mener un projet de mutagenèse ciblée chez la souris.

De par ses multiples collaborations en recombinaison homologue, est à même de conseiller sur la conception du transgène, et ceci afin de travailler dans les conditions les plus favorables, toujours avec l’objectif d’augmenter l’événement de recombinaison homologue.

Afin de faciliter le travail de l’équipe en charge du projet, le service met à disposition un certain nombre de matériels biologiques et techniques :

- Différents vecteurs (LoxP, FRT, Cre, FlpO, pROSA26_DEST)
- Cassettes de sélection (DT-A, hygro, néo,puro)
- Cellules ES wt 129/Sv J1, JM8.N4 (C57BL/6 N), E14Tg2a (129/Ola)
- Vecteur pour les iPS (pCX-OKS-2A et pCX-cMyc)
- Protocoles de mise en culture des cellules ES

Le service réalise la culture cellulaire pour obtenir des clones de cellules embryonnaires souches (ES) de souris recombinantes :

- Production et culture de cellules nourricières (MEFs), possédant un ou plusieurs gènes de résistance à un antibiotique (néomycine, puromycine, hygromycine, blasticidine) ainsi que leur cryoconservation

- Culture de cellules ES sur cellules nourricières préalablement inactivées (mitomycine C)

- Transfection des cellules ES par électroporation avec une construction comportant une partie de la séquence ADN du gène à inactiver et un gène de résistance à un antibiotique (néomycine, puromycine, hygromycine, blasticidine)

- Sélection des clones recombinants basée sur la résistance à l’antibiotique sur plusieurs semaines : repiquage, congélation des clones et amplification des cellules pour l’extraction de l’ADN en vue de son analyse. Une partie de ces clones est remise au porteur du projet pour la caractérisation par Southern blot

Le service assure un contrôle qualité des clones de cellules embryonnaires souches (ES) de souris recombinants :

- Réalisation des caryotypes (vérification de l’euploïdie)
- Numération des cellules ES (vérification du niveau de prolifération)
- Test mycoplasme

Le service réalise la micro-injection des clones de cellules ES recombinants dans les blastocystes BALB/c AnNCrl et C57BL/6-Tyrc-Brd

* Deux clones de cellules ES portant la mutation sont micro-injectés.
Environ 60 blastocystes sont injectés
(30 blastocystes/ clones).
L’étape de mico-injection est suivie de la réimplantation des blastocystes dans des souris pseudo-gestantes (au moins 4 femelles pseudo-gestantes/ clone).

* Après la micro-injection et la naissance des chimères, l’animalerie procède aux croisements des souris chimères ♂ avec les souris ♀ C57BL/6 FlpO délétères et/ou C57BL/6 WT.

NB  : Si les clones ES recombinants ne répondent pas aux critères de qualité mentionnés ci-dessus, ces derniers ne seront pas micro-injectés.

● Implication du chercheur dans la réalisation du projet

Etant donné qu’une seule personne est affectée au service, il est demandé à la personne responsable du projet de s’impliquer dans le projet à différents niveaux :

- Préparer et caractériser le vecteur pour l’électroporation des cellules ES
- Cribler des clones résistants afin d’identifier les clones où a eu lieu une recombinaison homologue par analyse de l’ADN par PCR et /ou Southern blot
- Fournir une copie des résultats de Southern Blot.

● Conditions

La personne intéressée, responsable du projet, devra nous contacter et remplir le formulaire « Request Form ».

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Request form KO KI
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Request form ES Cells





Note : Toute personne n’ayant pas rempli et renvoyé le formulaire ne verra pas sa demande prise en compte.


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Preparation of targeting vector DNA





● Garanties

- Sélection de clones ES recombinants :
Nous ne garantissons pas la génération de clones ES recombinants, car notez que celle-ci est dépendant du vecteur de ciblage. Cependant, suite à une première électroporation qui n’aurait pas donné au moins 2 clones ES recombinants, nous procèderons systématiquement à une deuxième électroporation.

- Production des souris chimères et transmission germinale (GLT) :
Si les cellules ES recombinées sont générées par d’autres centres (consortium ou autres), nous ne garantissons pas la génération de chimères ni la transmission germinale.

Par ailleurs, si les cellules ES recombinées sont généré par notre plate-forme, nous garantissons au moins 2 chimères. Cependant, veuillez noter que le taux de chimérisme (pourcentage de contribution du clone ES recombinant en comparaison au phénotype wt) varie considérablement, par conséquent il est possible qu’il n’y ait pas de transmission germinale.

● Nos tarifs

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Tarification 2013




● Fiche d’idée de croisements

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Fiche de croisements des chimères





● Publications

Les porteurs de projet s’engagent à citer le service dans le paragraphe « remerciements » ou « matériel et méthodes » des publications émanant de résultats obtenus avec ses équipements ou/et l’intervention du personnel du service. Mais également tout type de communication (posters et présenation orales).

● Liens

- International Knockout Mouse Consortium (IKMC) :
http://www.knockoutmouse.org/about

- The German Genetrap Consortium (CGTC) :
http://www.genetrap.de/

- Guide for designing and making targeting construct :
http://www.biotec.tu-dresden.de/research/stewart/group-page/genetargeting/

- A Database of Cre Transgenic Lines :
http://nagy.mshri.on.ca/cre_new/search/Search_Coop_try3.php

- A database of Cre and CreERT2 Transgenic Lines :
http://www.creline.org/

Mots-clés

Knock-out , Transgénèse , Développement , Différenciation

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